Daugumos virusų genominės sekos buvo žinomos.Nukleino rūgšties zondai, kurie yra trumpi DNR segmentai, skirti hibridizuotis su komplementariais viruso DNR arba RNR segmentais.Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra efektyvesnis viruso aptikimo būdas.Neseniai buvo sukurti didelio našumo diagnostikos metodai.
A. Nukleino rūgščių hibridizacijos technika
Nukleino rūgščių hibridizacija, daugiausia apimanti Southern blotting (Southern) ir Northern blotting (Northern), yra greitai besivystanti nauja virusų diagnostikos technika.Hibridizacijos tyrimo esmė yra naudoti trumpus DNR segmentus (vadinamus „zondu“), skirtus hibridizuotis su komplementariais viruso DNR arba RNR segmentais.Šildant arba apdorojant šarminiu būdu, dvigrandė tikslinė DNR arba RNR yra atskiriamos į atskiras grandines ir imobilizuojamos ant kieto pagrindo.Po to pridedamas zondas ir hibridizuojamas su tiksline DNR arba RNR.Kadangi zondas yra paženklintas izotopu arba neradioaktyviu nuklidu, tikslinę DNR arba RNR galima aptikti naudojant autoradiografiją arba biotino-avidino sistemą.Kadangi dauguma virusų genomų buvo klonuoti ir sekvenuoti, juos galima aptikti naudojant virusui būdingas sekas kaip mėginio zondus.Šiuo metu hibridizacijos metodai apima: dot blot, in situ hibridizaciją ląstelėse, DNR blotavimą (DNR) (Southern blot) ir RNR blotavimą (RNR) (Northern blot).
B.PCR technologija
Pastaraisiais metais buvo sukurta keletas in vitro nukleorūgščių amplifikacijos metodų, pagrįstų PGR, skirtų nejautriems arba nekultūringiems virusams tirti.PGR yra metodas, galintis sintetinti specifinę DNR seką in vitro polimerazės reakcijos būdu.PGR procesas apima trijų etapų terminį ciklą: denatūravimą, atkaitinimą ir pratęsimą Aukštoje temperatūroje (93 ℃ ~ 95 ℃) dvigrandė DNR yra atskiriama į dvi atskiras DNR grandines;tada žemoje temperatūroje (37 ℃ ~ 60 ℃) du susintetinti nukleotidų pradmenys susijungia su komplementariais DNR segmentais;kadangi esant tinkamam Taq fermento temperatūrai (72 ℃), naujų DNR grandinių sintezė prasideda nuo pradmenų 3' galo, naudojant komplementarią DNR kaip šabloną ir pavienius nukleotidus kaip medžiagas.Taigi po kiekvieno ciklo viena DNR grandinė gali būti amplifikuota į dvi grandines.Kartojant šį procesą, kiekviena per vieną ciklą susintetinta DNR grandinė gali būti naudojama kaip šablonas kitame cikle, o DNR grandinių skaičius padvigubinamas kiekviename cikle, o tai reiškia, kad PGR gamyba amplifikuojama 2n log greičiu.Po 25–30 ciklų PGR gamyba nustatoma elektroforezės būdu, o specifinius DNR produktus galima stebėti UV šviesoje (254 nm).Dėl specifiškumo, jautrumo ir patogumo PGR buvo pritaikytas daugelio virusinių infekcijų, tokių kaip HCV, ŽIV, CMV ir ŽPV, klinikinei diagnostikai.Kadangi PGR yra labai jautrus, jis gali aptikti viruso DNR fg lygiu, operacija turėtų būti atliekama labai atsargiai, kad būtų išvengta klaidingų teigiamų rezultatų.Be to, teigiamas nukleino rūgšties tyrimo rezultatas nereiškia, kad mėginyje yra gyvas infekcinis virusas.
Plačiai taikant PGR techniką, kuriami nauji metodai ir metodai, pagrįsti PGR technika įvairiems bandymų tikslams.Pavyzdžiui, realaus laiko kiekybinė PGR gali aptikti viruso kiekį;in situ PGR naudojama viruso infekcijai audiniuose ar ląstelėse nustatyti;Įdėta PGR gali padidinti PGR specifiškumą.Tarp jų realaus laiko kiekybinė PGR buvo sukurta greičiau.Daugelis naujų metodų, tokių kaip TaqMan hidrolizės zondas, hibridizacijos zondas ir molekulinis švyturio zondas, buvo sujungti į realaus laiko kiekybinę PGR techniką, kuri plačiai naudojama klinikiniuose tyrimuose.Šis metodas ne tik tiksliai identifikuoja viruso kiekį paciento kūno skystyje, bet ir gali būti naudojamas vaistams tolerantiškam mutantui aptikti.Todėl realaus laiko kiekybinė PGR daugiausia taikoma gydomojo poveikio vertinimui ir vaistų tolerancijos stebėjimui.
C. Didelio našumo virusinių nukleorūgščių aptikimas
Siekiant patenkinti naujų atsirandančių infekcinių ligų greitos diagnostikos poreikius, buvo sukurti įvairūs didelio našumo aptikimo metodai, tokie kaip DNR lustai (DNR).DNR lustams susintetinami specifiniai zondai ir labai didelio tankio prijungiami prie mažų silicio lustų, kad susidarytų DNR zondo mikrogardelė (DNR), kurią galima hibridizuoti su mėginiu.Hibridizacijos signalas gali būti vaizduojamas konfokaliniu mikroskopu arba lazeriniu skaitytuvu ir toliau apdorojamas kompiuteriu ir gali būti gautas didžiulis duomenų rinkinys apie skirtingus genus.Yra dviejų tipų DNR lustai.„Sintezės lustas“ yra toks: specifiniai oligonukleotidai sintetinami tiesiai ant lustų.Kitas yra DNR telkinio lustas.Klonuoti genai arba PGR produktai tvarkingai atspausdinami ant skaidrės.DNR lustų technologijos pranašumas yra didžiulio DNR sekų kiekio aptikimas vienu metu.Naujausia patogenų aptikimo lusto versija vienu metu gali identifikuoti daugiau nei 1700 žmogaus virusų.DNR lusto technologija išsprendė tradicinių nukleorūgščių hibridizacijos metodų problemas ir turi labai platų pritaikymą virusų diagnostikoje ir epidemiologiniuose tyrimuose.
Paskelbimo laikas: 2020-12-23